免疫沉淀实验是生物化学和分子生物学中研究蛋白质相互作用及表达状态的重要工具。根据实验需求，研究者可以选择不同的免疫沉淀方法，主要包括磁珠免疫沉淀法和固定免疫沉淀法。

磁珠免疫沉淀法

磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G结合特定抗体，捕获目标蛋白。这种方法以其操作简单、快速和高分离效率著称，特别适合进行高通量筛选和自动化实验。在实验中，磁珠通过磁性分离架进行快速分离，使得操作流程更加高效。此外，磁珠免疫沉淀法在深入研究蛋白质-蛋白质相互作用和信号传导通路时尤为有效。

固定免疫沉淀法

固定免疫沉淀法使用固定化抗体（通常是结合在珠子上的抗体）来捕获目标蛋白。这种技术通常应用于蛋白质印迹法（Western Blot）前的样品准备。虽然此方法需要较长的孵育时间来形成免疫复合物，但能够提供高特异性和灵敏度的结果，适用于目标蛋白的表达及修饰状态的定量分析。固定免疫沉淀法在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰和蛋白质稳定性时非常重要。

实验材料与试剂

所需的溶液与试剂包括：（1）PBS缓冲液；（2）1×细胞裂解缓冲液：20mM Tris（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、25mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸盐、1mM Na3VO4、1µg/ml 亮抑酶肽；（3）3×SDS样品缓冲液：187.5mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C）、6% w/v SDS、30% 甘油、150mM DTT、0.03% w/v 溴酚蓝。需要注意的是，以上溶液均需用超纯水制备，使用前需向细胞裂解液中添加1mM PMSF。

细胞裂解物的制备

1. 吸干培养基后，根据实验目的添加新鲜培养基，用以处理细胞。
2. 去除培养基，使用冰冷的PBS洗涤细胞一次。
3. 去除PBS，并在每块细胞培养板（10 cm）中添加0.5 ml预冷的1×细胞裂解缓冲液和1mM PMSF。
4. 在冰上孵育5分钟。
5. 轻轻刮下细胞，并转移至微量离心管，保持在冰上。
6. 在冰上对样品进行超声处理四次，每次5秒。
7. 在4°C下进行微量离心10分钟，将上清液转移至新的试管中。
8. 若不立即进行后续实验，需将裂解物储存于-80°C。

免疫沉淀法的步骤

1. 取200μl细胞裂解物，添加10µl固定抗体，并在4°C下轻微摇动，孵育过夜。
2. 在4°C下进行微量离心30秒。
3. 用500µl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物清洗，离心去除上清，共清洗五次，洗涤间期保持样品在冰上。
4. 使用20μl的3×SDS样品缓冲液重悬沉淀，涡旋混合后再进行30秒的微量离心。
5. 加热样品至95-100°C，保持2-5分钟。
6. 取15-30µl样品上样于SDS-PAGE凝胶，进行后续的蛋白质印迹实验。
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